Die Columbia begann ihren Flug von Cape Canaveral (KSC) und landete auf der Edwards AFB, Runway 22.

Der Start war ursprünglich für den 18. Dezember 1989 geplant, musste jedoch um etwa drei Wochen verschoben werden, weil die letzten Arbeiten und Tests an der umgebauten Startrampe mit Verspätung durchgeführt werden konnten. Ein zweiter Startversuch am 08. Januar 1990 musste wegen schlechten Wetters abgebrochen werden. Der Start wurde daher auf den folgenden Tag verschoben.

STS-32 hatte zwei Hauptmissionsziele: Der militärische Kommunikationssatellit Leasat 5 / Syncom-IV-F5 sollte ausgesetzt werden. Außerdem stand die Bergung der Long Duration Exposure Facility (LDEF) auf dem Flugplan der Columbia.

Am ersten Flugtag stand nach dem Öffnen der Frachtraumtüren nur noch der Test des Shuttle-Greifarms an. Der RMS war für das Einfangen von LDEF unerlässlich. Bonnie Dunbar konnte alle Tests erfolgreich abschließen.

Anders als bei früheren Flügen sollte das Aussetzen des militärischen Kommunikationssatellit Leasat 5 / Syncom-IV-F5 erst am zweiten Flugtag erfolgen. Die Syncom-Satelliten waren speziell auf das Aussetzen von Bord eines Space Shuttle gebaut. Mit einem Durchmesser von 4,26 Meter füllten sie den Frachtraum nahezu komplett aus. Die Höhe des Satelliten betrug mit eingefahrenen Antennen 2,85 Meter. In ausgeklapptem Zustand erreichte der Körper eine Höhe von 6,17 Meter. Zwei große Antennen und zwölf UHF-Verstärker dienen der Kommunikation. Sie arbeiten im Bereich von 240 bis 400 MHz. Die Syncom-Satelliten gehören zwar der Hughes Communications, sind aber komplett an die US Navy vermietet. Für den Antrieb verfügte der Satellit sowohl über ein Apogäums-Triebwerk als auch über einen integrierten "Perigee Kick Motor". Für die Syncom-Satelliten wurde das sogenannte "Frisbee Deployment" angewandt. Dabei versetzte ein Set vorgespannter Federn den Satelliten nicht nur in eine Translationsbewegung hinaus in den Frachtraum, sondern gleichzeitig in eine langsame Längsachsenrotation. Mit zwei Umdrehungen pro Minute verließ der Nachrichtensatellit die Nutzlastbucht des Raumgleiters.
Nachdem die Columbia in die richtige Position manövriert worden war, löste die Besatzung vier von fünf Haltevorrichtungen. Nach dem endgültigen "Go" wurde auch die letzte Haltevorrichtung entfernt. Diese war mit einem Sprengsatz gekoppelt, der eine Feder freisetzt. Damit wurde der Satellit in eine Anfangsrotation von 1,7 Umdrehungen versetzt und entfernte sich gleichzeitig mit 50 Zentimetern pro Sekunde aus dem Frachtraum. Ab diesem Moment wurde er nur noch Leasat 5 genannt. Im nächsten Schritt klappte die OMNI-Antenne aus. Da dieses Manöver bei STS-51D nicht funktioniert hatte und der Satellit später während des Fluges von STS-51I repariert werden musste, war dieser Vorgang von der Missionskontrolle und der Besatzung mit besonderer Spannung erwartet worden. Die Besatzung konnte dann beobachten, wie sich die Umdrehungsgeschwindigkeit von Leasat 5 auf 33 Umdrehungen pro Minute erhöhte. Die Piloten der Columbia vergrößerten anschließend den Abstand zu dem Satelliten und drehten ihm die Unterseite zu. Damit sollten Verunreinigungen bei der Zündung des "Perigee Kick Motor" durch dessen Abgase vermieden werden. Innerhalb der folgenden drei Tage wurde Leasat 5 durch mehrfache Zündungen der bordeigenen Triebwerke in eine geostationäre Erdumlaufbahn gebracht.

Beim Auswechseln der Lithium-Hydroxid-Kanister, die das Kohlendioxid aus der Atemluft filtern, entdeckte die Besatzung am dritten Flugtag ein Leck unterhalb des Mitteldecks. Etwa acht Liter Wasser waren bereits ausgetreten. Daniel Brandenstein und David Low saugten das Wasser mit Handtüchern und Strümpfen auf. An der Leckstelle wickelten sie ein Handtuch und eine Plastiktüte um den Ausgang des betroffenen Behälters. Damit wurde austretendes Wasser sofort aufgesaugt oder blieb in der Plastiktüte.

Eine ganze Reihe von Kurskorrekturen durch Zündungen der Columbia-Triebwerke waren nötig, um in die Nähe von LDEF zu gelangen. Am vierten Flugtag steuerte Daniel Brandenstein den Orbiter manuell so nahe an LDEF heran, dass die Plattform in Reichweite des Greifarms kam. Bonnie Dunbar an der Steuerung des RMS gelang es ohne Probleme, LDEF an einem Bolzen festzuhalten. Der antriebslose Körper hing nun über der Nutzlastbucht. Dort wurde er langsam von Bonnie Dunbar gedreht, sodass James Wetherbee, Marsha Ivins, David Low und Bonnie Dunbar alle Flächen von LDEF sehen und fotografieren konnten. Diese Fotoanalyse dauerte drei Stunden. Danach setzte Bonnie Dunbar LDEF in der Nutzlastbucht ab und die Plattform wurde dort durch fünf Schließmechanismen fest verankert. Das Absetzen von LDEF musste sehr vorsichtig erfolgen, weil das Gerät einen Durchmesser von 4,27 Meter hatte und die Nutzlastbucht nur 4,57 Meter breit war. Die Experimentierplattform war im April 1984 während der Mission STS-41C in den Orbit ausgesetzt worden. Die Plattform enthielt 57 wissenschaftliche, technologische Experimente und Anwendungen. Die Bergung hatte sich um viereinhalb Jahre verzögert, insbesondere durch das Challenger Desaster.

In den verbleibenden Flugtagen konzentrierten sich die Astronauten auf die im Mitteldeck befindlichen wissenschaftlichen Experimente:

"American Flight Echocardiograph" (AFE): Mit Hilfe von Ultraschall können innere Organe wie z.B. das Herz untersucht und auf Video aufgezeichnet werden. Damit wurde erforscht, wie das menschliche Herz auf die Schwerelosigkeit reagiert. Die Ergebnisse sollten für die Entwicklung von Gegenmaßnahmen bei Veränderungen der Herzgefäße verwendet werden. Das von Marsha Ivins betreute Experiment wurde bereits bei der Mission STS-51D eingesetzt.

"Interim Operational Contamination Monitor" (IOCM): Dabei handelte es sich um eine automatische Messeinrichtung, die jegliche Verunreinigung aufzeichnete, die in der Ladebucht vorhanden war.

"Characterization of Neurospora Circadian Rhythms" (CNCR): Ziel des Experimentes war es, Daten der inneren biologischen Uhr zu erhalten. Untersucht werde sollte auch, wie diese Vorgänge durch die Schwerelosigkeit beeinflusst werden.

"Protein Crystal Growth" (PCG): Dabei ging es um die Herstellung sehr großer Proteinkristalle und anderer organischer Makromoleküle mit möglichst fehlerfreier Struktur. Gegenüber den früher eingesetzten Systemen war unter anderem eine präzise Temperaturregelung möglich. Das Experiment wurde bereits bei STS-26 und STS-29 eingesetzt. Bei STS-32 wurden 120 unterschiedliche Experimente mit 24 Eiweißen durchgeführt.

"Fluids Experiment Apparatus" (FEA): Das Experiment stellt eine Art universell einsetzbares Labor für verschiedene kommerzielle material-technologische Versuche (Kristallwachstum, Fluid-Physik, Thermodynamik, chemische Untersuchungen von Flüssigkeiten und Gasen) dar. Die Proben können erhitzt, erstarrt, vermischt und in einer Zentrifuge beschleunigt werden. Der Versuchsablauf umfasste das Erhitzen von fünf Materialproben durch eine ringförmige Heizspirale, die langsam auf der Oberfläche verschoben wurde. Das polykristalline Material wird dabei geschmolzen und kühlt hinter der Heizspirale als Monokristall wieder ab. Auf diese Weise können besonders reine Monokristalle hergestellt werden.

"Mesoscale Lightning Experiment" (MLE): Ziel des Experiments war es, auf der Nachtseite der Erde Aufnahmen von Blitzen zu machen. Es sollte herausgefunden werden, wie sich Blitzentladungen gegenseitig beeinflussen. Neben einer Videokamera in der Ladebucht kam eine 35-mm-Kamera mit hochempfindlichem Film (400 ASA) zum Einsatz. Das Experiment sollte der Entwicklung Sensoren in Frühwarn- und Vorhersagesysteme für Sturmgebiete dienen.

"IMAX Camera": Das IMAX-System wurde bereits während der Flüge STS-41C, STS-41D, STS-41G, STS-61B und STS-29 eingesetzt. Bei den Aufnahmen während des Fluges von STS-32 ging es um den neuen Film "The Blue Planet". Dafür sollten Vulkane in Mittelamerika, Gebiete in Afrika und Indonesien, gerodete Waldgebiete in Brasilien, das Amazonasbecken, Flusstäler in Madagaskar und natürlich die Bergung von LDEF aufgenommen werden. IMAX ist das größte Filmformat überhaupt und liefert sehr hochwertige Großformatbilder.

"Air Force Maui Optical System" (AMOS): Es handelt sich um ein elektrisch-optisches Instrument, das auf der Hawaii-Insel Maui installiert ist. Mit ihm soll das Space Shuttle im Orbit einschließlich Triebwerkszündungen und Ablassen von Brauchwasser verfolgt werden. An Bord des Orbiters sind dafür keine Instrumente erforderlich.

"Latitude-Longitude Locator" (L3): Mit diesem System sollten aus einer Erdumlaufbahn die geografische Länge und Breite eines beobachteten Objektes bestimmt werden.

"Lower Body Negative Pressure" (LBNP): Das Experiment war von Bedeutung für den Ausgleich der Körperflüssigkeiten insbesondere beim Wiedereintritt in die Erdatmosphäre.

"Text and Graphics System" (TAGS): Das ist eine Art Faxgerät, das mittels Lasertechnik auch hochqualitative Bilder zum Orbiter übermitteln kann. Das System sollte den bisher verwendeten Standard-Teleprinter ablösen.

Die Columbia war als Träger für verschiedene OEX-Experimente ausgewählt worden. Dabei sollte das Space Shuttle als Versuchsobjekt für Wiedereintrittsexperimente genutzt werden. Zu den Versuchsanordnungen gehörten:
"Shuttle Entry Air Data System" (SEADS): Es handelte sich um eine Anordnung von Druckmessgeräten in der Bugnase, um den Staudruck zu messen. Die Druckmessungen begannen in etwa 85 km Höhe und dauerten bis zur Landung. Ebenso wurden Messungen in der Startphase durchgeführt.
"Shuttle Upper Atmospere Mass Spectrometer" (SUMS): Für Messungen oberhalb von 80 km war im Bugfahrwerksschacht ein automatisches Massenspektrometer installiert. Damit konnten selbst kleinste Luftmengen Auskunft darüber geben, wie die Atmosphärendichte ist.
"Shuttle Infrared Leeside Temperature Sensing" (SILTS): Am oberen Ende des Seitenleitwerks war ein aerodynamisch verkleideter Pod angebracht worden, der eine hochauflösende Infrarotkamera enthielt. Damit konnten genaue Temperaturverteilungskarten erstellt werden. Der Infrarotsensor konnte Temperaturen von 93 bis 538 Grad Celsius erfassen und wurde mit Hilfe von Stickstoff gekühlt.