STS-65 startete von Cape Canaveral (KSC und landete auch wieder in Cape Canaveral (KSC), Runway 33.

Mit diesem Flug wurde die Mission "International Microgravity Laboratory" (IML-2) durchgeführt. Hierbei handelte es sich um verschiedene Experimente zur Erforschung der Mikrogravitation auf Metallschmelzen und lebende Organismen. Von deutscher Seite gab es dazu die Experimentieranlagen TEMPUS (Berührungsfreier Schmelzofen) und NIZEMI (Niedergeschwindigkeits-Zentrifugen-Mikroskop), das dazu diente bei verschiedensten Organismen (Kressesamen, Schleimpilzen, Pantoffeltierchen) den Punkt zu bestimmen, an dem diese Organismen auf Schwerkraft reagieren. Außerdem gab es noch eine Messanlage, um auch kleinste Gravitationsschwankungen zu messen und ein Aquarium mit kleinen Molchen und Quallen. Die Ergebnisse waren weniger spektakulär als noch bei D-2 (STS-55), wissenschaftlich betrachtet aber sicherlich ähnlich erfolgreich. Zwei der mitgeführten erwachsenen Molche überlebten die Reise aber nicht.

Da die Experimente rund um die Uhr liefen, waren zwei Teams gebildet worden: das rote Team mit Robert Cabana, James Halsell, Richard Hieb und Chiaki Mukai sowie das blaue Team mit Leroy Chiao, Donald Thomas, und Carl Walz.

Zu den Life Sciences Experimenten gehörten: "Aquatic Animal Experiment Unit" (AAEU) im Rack 3, "Biorack" (BR) im Rack 5, "Biostack" (BSK) im Rack 9, "Extended Duration Orbiter Medical Program" (EDOMP) und "Spinal Changes in Microgravity" (SCM) im Center Isle, "Lower Body Negative Pressure Device" (LBNPD), "Microbial Air Sampler" (MAS), "Performance Assessment Workstation" (PAWS) im Mitteldeck, "Slow Rotating Centrifuge Microscope" (NIZEMI) im Rack 7, "Real Time Radiation Monitoring Device" (RRMD) und der "Thermoelectric Incubator" (TEI) beide im Rack 3. Mikrogravitations-Experimente waren: "Applied Research on Separation Methods" (RAMSES) im Rack 6, "Bubble, Drop and Particle Unit" (BDPU) im Rack 8, "Critical Point Facility" (CPF) im Rack 9, "Electromagnetic Containerless Processing Facility" (TEMPUS) im Rack 10, "Free Flow Electrophoresis Unit" (FFEU) im Rack 3, "Large Isothermal Furnace" (LIF) im Rack 7, "Quasi Steady Acceleration Measurement" (QSAM) im Rack 3, "Space Acceleration Measurement System" (SAMS) im Center Isle und das "Vibration Isolation Box Experiment System" (VIBES) im Rack 3.

Während des sehr erfolgreichen Fluges gab es kleinere Probleme, die die Besatzung aber weitgehend bewältigen konnte:
Ein Antriebriemen der Zentrifuge des Biorack musste ausgetauscht werden.
Das erste Überspielen von Daten von Kontrollzentrum zum Laptop der Columbia klappte nicht. Es stellte sich heraus, dass die Version der benutzten Software in Houston eine andere war, als an Bord der Columbia.
Probleme gab es auch mit den vier Videorekordern, die zum Aufzeichnen der Vorgänge bei unterschiedlichen Experimenten eingesetzt wurden.
Die japanische "Free-Flow Electrophoresis Unit" (FFEU) konnte nicht aktiviert werden, weil eine Pumpe offenbar keinen ausreichenden Druck zur Kontrolle der Einheit lieferte. Erst nach etlichen Versuchen konnte das Experiment in Gang gesetzt werden.

Die Columbia war als Träger für verschiedene OEX-Experimente ausgewählt worden. Dabei sollte das Space Shuttle als Versuchsobjekt für Wiedereintrittsexperimente genutzt werden. Zu den Versuchsanordnungen gehörten:
"Shuttle Entry Air Data System" (SEADS): Es handelte sich um eine Anordnung von Druckmessgeräten in der Bugnase, um den Staudruck zu messen. Die Druckmessungen begannen in etwa 85 km Höhe und dauerten bis zur Landung. Ebenso wurden Messungen in der Startphase durchgeführt.
"Shuttle Upper Atmospere Mass Spectrometer" (SUMS): Für Messungen oberhalb von 80 km war im Bugfahrwerksschacht ein automatisches Massenspektrometer installiert. Damit konnten selbst kleinste Luftmengen Auskunft darüber geben, wie die Atmosphärendichte ist.
"Shuttle Infrared Leeside Temperature Sensing" (SILTS): Am oberen Ende des Seitenleitwerks war ein aerodynamisch verkleideter Pod angebracht worden, der eine hochauflösende Infrarotkamera enthielt. Damit konnten genaue Temperaturverteilungskarten erstellt werden. Der Infrarotsensor konnte Temperaturen von 93 bis 538 Grad Celsius erfassen und wurde mit Hilfe von Stickstoff gekühlt.

Wegen schlechten Wetters in Florida konnte die erste Landemöglichkeit nicht genutzt werden. Die Flugleitung ordnete daraufhin eine 24-stündige Flugverlängerung an. Es wurde der bis dahin längste Flug eines Space Shuttle.