Start von Cape Canaveral (KSC); Landung in Cape Canaveral (KSC), Runway 33. Eigentlich sollte der Start am 23. März 1992 durchgeführt werden. Eine während der Betankung aufgetretene überhöhte Treibstoffkonzentration (Flüssigwasserstoff und -sauerstoff) im Orbiterheck erzwang eine 24-stündige Startverschiebung.

Nach dem Abschalten der Haupttriebwerke wurde festgestellt, dass die Atlantis etwas zu langsam flog. Anstatt der geplanten 27.432 km/h betrug die Geschwindigkeit nur 27.415,5 km/h, was zu einer elliptischen Umlaufbahn von 296 x 285 km führte. Mit einer nicht eingeplanten Zündung des linken OMS-Triebwerks für 14 Sekunden wurde ein kreisrunder Orbit von 296 km Höhe erreicht.

Die Mission beförderte das erste Atmospheric Laboratory for Applications and Science (ATLAS-01 - Erdumwelt- und Atmosphärenforschungslabor) auf zwei Spacelab-Paletten in der Ladebucht des Shuttles. ATLAS-01 bestand aus 14 Experimenten, darunter 13 zur Erforschung der Erdatmosphäre und das Zusammenspiel mit der eingestrahlten Sonnenenergie. Das 14. Instrument war ein Teleskop zur Untersuchung der ultravioletten Strahlung aus unserer Milchstraße. Man erhoffte sich dadurch mehr Informationen über die jungen Lebensphasen eines Sterns, weil während der Entstehungszeit des Sterns Lichtstrahlen von umgebenden Staubwolken zurückgehalten werden. In dieser Phase ist der Stern also optisch unsichtbar.

Die in der Nutzlastbucht installierte Ladung bestand aus Instrumenten aus den USA, Frankreich, Deutschland, Belgien, der Schweiz, den Niederlanden und Japan. Es wurden Studien in den Bereichen Atmosphärenchemie, Sonneneinstrahlung, Plasmaphysik und Ultraviolett-Astronomie durchgeführt.

Die meisten Instrumente waren computergesteuert, d.h. ihre Daten wurden direkt zu den Wissenschaftlern am Spacelab Operations Control Center in Houston übertragen. Dagegen wurden die Experimente zur Plasmaphysik von der Mannschaft manuell bedient. So übermittelten sie z.B. ihre Beobachtungen den Wissenschaftlern am Boden, während sie mit einer Elektronenkanone geladene Teilchen in das umgebende Plasma schossen. Ebenso mussten die Astronauten das Ausrichten und Einstellen Videokameras sowie die Auswahl der benötigten Kamerafilter übernehmen.

Sechs Experimente zur Atmosphärenforschung untersuchten die mittleren und oberen Atmosphärenschichten (etwa ab 11 km Höhe). Für die Wissenschaftler war dabei besonders interessant, wie die Zusammensetzung, Temperatur und Druck mit der Sonneneinstrahlung zusammenhängten.
Das Imaging Spectrometric Observatory (ISO), das bereits bei STS-9 im Einsatz war, untersuchte mit spektrokopischen Mitteln die Zusammensetzung der Atmosphäre.
Das Millimeter-Wave Atmospheric Sounder (MAS) maß die Intensität der Mikrowellenstrahlung, die von Wasserdampf, Chlormonoxid und Ozon emittiert wird. Das von der Firma Dornier gebaute MAS war 200 kg schwer und hatte eine bewegliche Antenne, die ein Abtasten der Erdatmosphäre zwischen 10 und 100 km Höhe ermöglichte. Zur Kalibrierung wurde die Antenne nach jeder 12,8 Sekunden dauernden Messperiode auf 130 km Höhe geschwenkt, damit die genau bekannte Temperatur des kalten Weltraums als Referenz herangezogen werden konnte.
Das Shuttle Solar Backscatter Ultraviolet Experiment (SSBUV) war bereits bei STS-34, STS-41 und STS-43 an Bord eines Space Shuttle. Es hat die Aufgabe, die Ozonschicht der Erdatmosphäre zu untersuchen. Sinn und Zweck des Experimentes ist die Eichung von Instrumenten an Bord der Satelliten NOAA-9, NOAA-11 und Nimbus-7, um die Konzentrationsschwankungen des Ozons genau zu dokumentieren.
Die vier Experimente Active Cavity Radiometer (ACR), Measurement of Solar Constant (SOLCON), Solar Spectrum Measurement (SOLSPEC) und Solar Ultraviolet Spectral Irradiance Monitor (SUSIM) maßen die Energieabstrahlung der Sonne. Untersucht wurden die spektrale Verteilung und Intensitätsschwankungen und ihre Auswirkungen auf die Ionosphäre und die Zusammensetzung der Erdatmosphäre. Astrophysiker wollen damit die physikalischen Prozesse innerhalb der Sonne besser verstehen.
Das Ultraviolett-Teleskop FAUST sowie zwei weitere Experimente zur Plasmaphysik AEPI (Atmospheric Emissions Photometric Imaging) und SEPAC (Space Experimente with Particle Accelerators) waren ebenfalls bei STS-9 (Spacelab-1) im Einsatz.

Daneben waren an Bord der Atlantis noch sogenannte sekundäre Experimente, die u.a. in Get Away Special (GAS) Kanistern untergebracht waren.

Wie bei früheren Spacelab-Missionen gab es wieder ein Rotes Team (David Leestma, Michael Foale und Byron Lichtenberg) und ein Blaues Team (Charles Bolden, Brian Duffy, Kathryn Sullivan und Dirk Frimout), das sich die anfallenden Arbeiten im Schichtbetrieb teilte.

Charles Bolden und Brian Duffy mussten während dieser Mission mehr als 250 Manöver fliegen, um die Atlantis für die ATLAS-Experimente in die jeweils richtige Position zu bringen. Um alle Experimente durchführen zu können, wurde der Flug um einen Tag verlängert.