STS-27 startete von Cape Canaveral (KSC) und landete nach gut vier Flugtagen auf der Edwards AFB, Runway 17.

Da sich die amerikanischen Teilstreitkräfte trotz häufiger Verzögerungen zeitweise ganz auf das Space Shuttle für den Transport ihrer Satelliten und andere Aufgaben verlassen hatten, entstand mit der Explosion der Challenger im Januar 1986 ein erhebliches Problem. Die USA verfügten kaum noch über konventionelle Trägerraketen insbesondere für den Transport von Nachrichtensatelliten in den geostationären Orbit. Die Lage verschärfte sich noch durch die Fehlstarts von zwei Trägerraketen vom Typ Titan 34D, die militärische Nutzlasten an Bord hatten. Darüber hinaus war ein Aufklärungssatellit vom Ausfall bedroht. Die USA drohten im Weltraum zu "erblinden". Als die Wiederaufnahme der Shuttle-Flüge näher rückte, bestanden die Militärs darauf, dass gleich zu Beginn der Post-Challenger-Ära mehrere Missionen unter strengster Geheimhaltung ablaufen müssten, weil ansonsten die militärische Sicherheit der USA nicht zu gewährleisten sei.

Gleich der zweite Flug sollte ein rein militärischer Einsatz des Orbiters werden. Während der Flugpause nach der Explosion der Challenger gab die USAF ihren fast vollständig fertigen Weltraumflughafen im kalifornischen Vandenberg auf und mottete ihn ein. Der erste dort vorgesehene Flug STS-62A wurde nicht mehr durchgeführt. Allerdings steht STS-27 in dessen Nachfolge. Von der ursprünglichen Besatzung waren mit Guy Gardner, Jerry Ross und Michael Mullane immerhin noch drei Astronauten geblieben. Einen MSE gab es nicht mehr, denn die USAF löste das MSE-Astronautenteam noch vor der Wiederaufnahme der Shuttle-Flüge auf.
Als Starttermin peilte die NASA zunächst den 08. September 1988 und dann den 21. Oktober 1988 an. Beide Termine konnten nicht gehalten werden, weil sich bereits STS-26 verzögert hatte und danach noch Modifikationen an der Atlantis vorgenommen werden mussten. Schließlich erschien ein Start um den Monatswechsel November / Dezember 1988 realistisch. Der erste Startversuch am 01. Dezember 1988 musste wegen zu starker Winde abgesagt werden, obwohl sich die Besatzung bereits an Bord befand. Der nächste Versuch sollte 24 Stunden später erfolgen.

Wesentliche Missionsaufgabe war das Aussetzen eines militärischen Radaraufklärungssatelliten. Daneben standen noch verschiedene kleinere Experimente auf dem Flugplan. Da der gesamte Flug einschließlich des Sprechfunkverkehrs der Geheimhaltung unterlag, wurden im Vorfeld nur wenige Einzelheiten bekannt. Erst nach Beendigung der Mission gelangten weitergehende Informationen an die Öffentlichkeit. Sogar die genaue Startzeit wurde erst neun Minuten vor dem Abheben veröffentlicht.

Achteinhalb Minuten nach dem Start erreichte die Atlantis die Erdumlaufbahn und öffnete die Frachtraumtüren. Dies geschieht üblicherweise nach 90 Minuten Flugzeit und verhindert die Überhitzung des Orbiters. Während des Aufstiegs waren einige Hitzeschutzkacheln beschädigt worden bzw. verloren gegangen. Allerdings beeinträchtigte dies die Sicherheit bei der Landung nicht.

Einen Tag nach dem Start erledigte die Besatzung ihre Hauptaufgabe. Mit Hilfe des Greifarms der Atlantis hob sie den Aufklärungssatelliten aus der Ladebucht des Orbiters heraus und entließ ihn auf eine eigene Umlaufbahn. Dem Vernehmen nach soll es sich um einen Satelliten mit dem Namen Lacrosse (USA-34) gehandelt haben. Diese Neuentwicklung soll die Fähigkeit besitzen, wetterunabhängig und auch bei Dunkelheit Bodenziele mit einem Auflösungsvermögen von acht Zentimetern das Territorium der damaligen UdSSR aufzuklären. Lacrosse soll 18,2 Tonnen schwer gewesen sein und habe eine 30,5 Meter lange Radarantenne sowie eine Sendeantenne gehabt. Die Spannweite der ausgefahrenen Solarzellenflächen soll 100 Meter betragen haben.

Über den weiteren Fortgang nach dem Aussetzen von Lacrosse gibt es unterschiedliche Versionen.
Einerseits hieß es, die Radarantenne und die Sendeantenne seien ebenso wie die Solarzellenflächen ordnungsgemäß ausgefahren und der Satellit sei mit seinen eigenen Steuerdüsen auf die vorgesehene Umlaufbahn befördert worden. Beim Auftreten einer manövermäßigen Panne sollte die Ausrüstung mit der Elektronikbaugruppe des Satelliten abgesprengt und von der Besatzung wieder geborgen werden.
Nach einer anderen Version soll nach dem Aussetzen ein nicht näher genanntes Problem aufgetreten sein. Der Satellit sei nach inoffiziellen Angaben zunächst ausgefallen, sodass Jerry Ross und/oder William Shepherd nach einem erneuten Rendezvous möglicherweise eine EVA durchführen mussten, um den Satelliten zu reparieren. Danach soll das Problem beseitigt gewesen sein. Eine Bestätigung für die Durchführung einer EVA wurde bis heute nicht gegeben.
Zu beiden Versionen wurden weder von der NASA noch den beteiligten militärischen Dienststellen Erklärungen abgegeben.

Nach der Erledigung ihrer Hauptaufgabe führte die Besatzung kleinere Experimente durch, die aber ebenfalls der Geheimhaltung unterlagen. Es soll sich aber um Beobachtungen mit speziellen Doppelferngläsern zwecks verbesserter Erkundungsmöglichkeiten von militärischen Bewegungen gehandelt haben.

Die Landung auf der Edwards AFB hatte sich offenbar um mehrere Stunden verzögert, weil durch ein Leck fast acht Liter Kühlflüssigkeit ausgetreten war. Um eine Gefährdung der Orbiter-Elektronik zu verhindern, mussten die Astronauten die ausgetretene Flüssigkeit mit Schläuchen über die Toilette abpumpen.

Wie sich nach der Landung herausstellte, wäre es bei dieser Shuttle-Mission beinahe zu einer Katastrophe gekommen, ähnlich wie die Columbia-Katastrophe 15 Jahre später. Auch hier hatte sich ein Stück Isoliermaterial gelöst und den Hitzeschutzschild beschädigt. 175 Kacheln fehlten danach ganz, letztlich waren 300 Kacheln beschädigt und mussten ausgetauscht werden. Auf übermittelten Fotos konnten die Schäden im All nicht einwandfrei erkannt werden, was wohl an schlechten Kameras und der verschlüsselten Übergabe von Daten lag. Die Katastrophe wurde wahrscheinlich lediglich durch den glücklichen Umstand verhindert, dass sich genau an der Stelle unter der fehlenden Kachel eine stärkere Metallplatte befand, die als Verankerung für eine Antenne diente. Das Hitzeschild wies die gravierendsten Beschädigungen auf, die bis heute an einem Space Shuttle festgestellt worden sind.