Start von Cape Canaveral (KSC) sowie Landung auf Cape Canaveral (KSC), Runway 33.

Bei der Mission STS-131 (ISS-MPLM Leonardo) wurden das Logistikmodul Leonardo sowie der LMC-Träger genutzt, um Fracht zur ISS zu bringen. Darunter befand sich unter anderem ein Ammoniaktank, der mit STS-128 zur Erde zurückgeholt und nun wiederbefüllt zur Station zurückgebracht wurde. Im Rahmen von drei Weltraumausstiegen wurden der Austausch des Tanks sowie verschiedene Wartungsarbeiten an der Station durchgeführt.

Das Multi-Purpose Logistics Module (MPLM) Leonardo, (Deutsch Mehrzwecklogistikmodul), wurde verwendet, um bei Space-Shuttle-Missionen Frachten zu und von der Internationalen Raumstation (ISS) in einem unter Luftdruck stehenden Raum zu transportieren.
Das Modul wurde während des Transportes mit dem Shuttle in dessen Ladebucht befestigt. Nach dem Andocken an die ISS wurde das MPLM mit Hilfe des Roboterarmes Canadarm2 aus der Ladebucht gehoben und am Harmony-Modul angekoppelt. Anschließend wurde die Luke des Moduls geöffnet und die Astronauten erhielten Zugang zum MPLM, um es zu entladen sowie mit den zur Erde zu bringenden Frachten zu beladen. Bevor das Shuttle von der Station ablegte, wurde das Modul wieder in der Ladebucht befestigt und kehrte anschließend zusammen mit der Raumfähre zur Erde zurück.
Der wesentliche Vorteil dieses Verfahrens lag darin, dass Transportgüter, insbesondere die sogenannten International Standard Payload Racks, direkt vom MPLM in den amerikanischen Teil der Station verladen werden konnten. Kopplungsadapter vom APAS-Typ russischer Bauart, die auch zum Andocken des Space Shuttles benutzt werden, haben einen wesentlich geringeren Durchmesser und lassen kein Verladen sperriger Gegenstände zu. Weiterhin ermöglichte der Einsatz des MPLM, nicht mehr benötigte Ausrüstung und beendete Experimente zurück zur Erde zu transportieren. Andere Transportschiffe wie die unbemannten Progress- und ATV-Frachter verglühen beim Wiedereintritt und transportieren daher ausschließlich Müll von der Station ab.

Nach dem Erreichen der Erdumlaufbahn öffnete die Besatzung die Frachtraumtüren der Discovery, testete den Greifarm RMS in seinen verschiedensten Funktionen, klappte die für das Rendezvous eigentlich erforderliche Ku-Band-Antenne aus. Dabei stellte sich heraus, dass die Datenübertragung zu den TDRS nicht funktionierte. Dadurch stand für das Shuttle keine ausreichende Möglichkeit der Echtzeitübertragung während der Inspektion des Hitzeschildes mithilfe des Orbiter Boom Sensor System (OBSS) zur Verfügung, die Daten wurden stattdessen an Bord der Discovery gespeichert. Die schüsselförmige Radarantenne wird außer beim Rendezvous-Manöver mit der Raumstation auch zur Übertragung von Videos und Daten zwischen Boden und Raumschiff über NASA-Kommunikationssatelliten verwendet. Der Ausfall der Antenne beeinträchtigte nicht den erfolgreichen und sicheren Verlauf der Mission. Die Discovery begann trotzdem mit der Angleichung der Flugbahn zur Internationalen Raumstation. Ebenso montierten sie im "Orbiter Docking System" die "Centerline Camera", die Kommandant Alan Poindexter das spätere Docking erleichtern soll.
Außerdem wurde der Hitzeschild der Discovery auf eventuelle Schäden untersucht, die beim Start durch sich vom Außentank ablösende Isolierschaumstücke entstanden sein könnten. Dabei wurde der OBSS-Inspektionsarm eingesetzt, der nach dem Columbia-Unglück entwickelt wurde. Der OBSS ist ein 15 Meter langer "Aufsatz", der mit dem Roboterarm des Shuttles verbunden wird. Der Kopf des OBSS ist mit Laser-Sensoren und hochauflösenden Kameras ausgestattet und tastet halbautomatisch die Hitzeschutzkacheln des Orbiters ab. Die gewonnenen Bilder und Daten mussten bei STS-131 bis zum Erreichen der ISS zwischengespeichert werden.

Den Gesetzen der Bahnmechanik folgend holte die Discovery von ihrer ersten Umlaufbahn und weiteren Triebwerkszündungen in den folgenden beiden Tagen immer mehr zur Internationalen Raumstation auf. Am dritten Flugtag, dem 07. April 2010, hatte die Discovery einen Punkt 15 Kilometer hinter der Raumstation erreicht. Für den Anflug im Rahmen des sogenannten "R-Bar Approach" musste das Space Shuttle nochmals seine Bahn senken, sodass sich die Discovery schließlich etwa 180 Meter unterhalb der Internationalen Raumstation befand. Ab dieser Distanz übernahm Alan Poindexter die manuelle Steuerung und flog entlang des sogenannten "R-Bar" (gedachte Verbindungslinie zwischen der Raumstation und dem Erdmittelpunkt) hinauf zur ISS. In der Nähe der Station führte Alan Poindexter ein spektakuläres 360°-Manöver - das Rendezvous Pitch Maneuver (RPM) - durch, wobei er die Raumfähre innerhalb weniger Minuten um ihre Querachse drehen ließ. Die Besatzung der Raumstation fertigte währenddessen hochauflösende Aufnahmen des Shuttle-Hitzeschildes an. Die Aufnahmen werden später zur Erde übertragen und von Fachleuten ausgewertet. Mit einer direkt vor der ISS reduzierten Annäherungsgeschwindigkeit auf zuletzt nur noch 3 Zentimeter pro Sekunde flog der Orbiter auf den Ankopplungsstutzen der Internationalen Raumstation zu. Wie die Kommandanten bei allen Kopplungsmissionen steuerte er den Raumgleiter von der hinteren Konsole im Flugdeck aus, weil er von dort freie Sicht auf die Raumstation hatte. Ohne Probleme konnte er sein Raumschiff an die ISS ankoppeln.

Direkt nach der Begrüßung durch die Mannschaft der ISS Expedition 23 wurde mit der Übertragung der Daten aus dem Rendezvous Pitch Maneuver (RPM) und aus der Inspektion des Hitzeschutzschildes des Vortages an die NASA begonnen. Dazu wurde die intakte Ku-Band-Antenne der ISS benutzt.

Am 08. April 2010 wurde das Leonardo Multipurpose Logistics Module von der Ladebucht der Discovery zu einem Andockpunkt am Modul Harmony umgesetzt. Das in Italien gebaute Modul enthält mehr als 7700 Kilogramm Versorgungsgüter. Darunter befinden sich vier Racks mit Experimenten sowie die letzten persönlichen Schlafkabinen für die Besatzung. Dies ist der letzte Einsatz des 6,4 Meter langen und 4,5 Meter breiten Moduls Leonardo. Nach der Rückkehr zur Erde wird das Modul mit einem Schutzschild an der Außenseite versehen. Die Mission STS-133 im Februar 2011 brachte Leonardo dann als dauerhaftes Modul zur Raumstation.

Die erste EVA durch Richard Mastracchio und Clayton Anderson wurde am 09. April 2010 (6h 27m) unternommen. Dabei wurde mit Hilfe des Roboterarms zunächst ein Ammoniak-Tank aus der Nutzladebucht gehoben und vorübergehend an der Station verstaut. Dieses Vorgehen war nötig, da der Greifarm der ISS nicht von einer Basis aus sowohl die Nutzlastbucht als auch die endgültige Position erreichen kann, sondern die Basis wechseln muss, während sich der Tank auf der Zwischenposition befindet. Ammoniak wird benötigt, um überschüssige Wärme aus der Station zu den Radiatoren außerhalb der Station zu leiten. Dann bargen die beiden Astronauten ein Samen-Experiment von außerhalb des japanischen Labors. Anschließend wurden Haltevorrichtungen an den Ammoniak-Tank angebracht und ein defektes Gyroskop des Navigationssystems der Station ausgetauscht. Da die beiden Astronauten gut im Zeitrahmen lagen, wurden schon einige Arbeiten, die eigentlich später geplant waren, gleich mit erledigt, indem man z.B. schon 11 von 12 Befestigungsklammern löste.

Zwischenzeitlich entschieden die Manager der Mission, den Flug um einen Tag zu verlängern. So sollte eine späte Inspektion des Hitzeschildes der Discovery noch während der Kopplung mit der ISS gewährleistet werden. Durch die defekte Ku-Band-Antenne der Discovery war es nötig, die Antenne der ISS zu benutzen. Es wurde weitere Fracht aus Leonardo in die Station transportiert, darunter die Window Observational Research Facility (WORF), die am gegen die Erde gerichteten Fenster des US-Moduls Destiny angebracht wurde. Richard Mastracchio und Clayton Anderson trafen Vorbereitungen für ihren nächsten Außenbordeinsatz, bei dem der neue Ammoniaktank an seine endgültige Position gebracht werden soll.

Die zweite EVA durch Richard Mastracchio und Clayton Anderson erfolgte am 11. April 2010 (7h 26m). Mit Hilfe des Stationsarmes wurde der leere Ammoniaktank von der Gitterstruktur ITS abgebaut und vorübergehend auf dem CETA verstaut. Anschließend wurde der neue Tank eingesetzt und befestigt. Während dieser EVA gab es aber massive Probleme mit einem Bolzen, um den Ammoniaktank zu befestigen. Der gesamte Zeitplan geriet durcheinander, bevor es Clayton Anderson dann doch nach 1,5 Stunden noch schaffte. Kühlleitungen konnten dann aber nicht mehr verlegt werden. Mit dem Stationsarm wurde dann der leere Tank nochmals versetzt.

Die dritte und letzte EVA führten Richard Mastracchio und Clayton Anderson am 13. April 2010 (6h 24m) durch. Zunächst wurden die schwierigen Arbeiten beim Wechseln des Ammonik-Tanks beendet. Mit Hilfe des Greifarms der Station wurde der leere Ammoniaktank in die Ladebucht des Shuttle verfrachtet. Danach wurden die Haltevorrichtungen vom alten Tank entfernt und auf der Werkzeugplattform verstaut. Richard Mastracchio und Clayton Anderson bargen zum Abschluss dieser EVA noch einige Schutzkacheln vom Quest-Modul, um sie mit zur Erde zurückzubringen. Wegen der Verzögerungen wurden die geplante Installation einer Platte sowie einer Kamerabeleuchtung an Dextre, die Entfernung von Isoliermatten und die Auswechselung eine durchgebrannte Birne an einer Kamera an der Gitterstruktur ITS nicht mehr durchgeführt.

Danach versuchten die Ingenieure in der Kontrollstation ein klemmendes Ventil im Bereich des Stickstoff-Tanks zu lösen. Das Ventil ist erforderlich, um den durch die Astronauten der Discovery bei drei Außeneinsätzen von Richard Mastracchio und Clayton Anderson installierten Ammoniak-Tank unter Druck zu setzen.
Nach einigen Diskussionen entschieden die Flugleiter den erwogenen zusätzlichen Weltraumspaziergang und die dadurch erforderliche weitere Flugverlängerung um einen Tag nicht durchführen zu lassen. In dieser Zeit hätte der Stickstoff-Tank im Kühlsystem der Internationalen Raumstation ausgetauscht werden können. Die Ingenieure kamen zu dem Ergebnis, dass das Kühlsystem auch ohne das klemmende Ventil für einen längeren Zeitraum sicher betrieben werden kann.

Am 15. April 2010 verlegten Stephanie Wilson und Naoko Yamazaki das Leonardo Multipurpose Logistics Module mit Hilfe der Roboterarms der Raumstation zurück in die Ladebucht der Discovery, um Leonardo zurück zur Erde zu bringen.
Das Logistikmodul Leonardo wurde mit erheblicher Verspätung von der ISS abgekoppelt und über Nacht in eine Parkposition über die Ladebucht der Space Shuttle gebracht. Erst am nächsten Morgen verankerten die Astronauten das Modul an der Discovery.
Die Rückverlegung von Leonardo in die Ladebucht der Discovery hatte sich wegen Problemen mit den Haltebolzen des MPLM verzögert.

Danach begannen Stephanie Wilson, Dorothy Metcalf-Lindenburger und Discovery Pilot James Dutton mit der späten Inspektion des Hitzeschutzschildes der Discovery. Sie arbeiteten in Schichten mit Hilfe von Kommandant Alan Poindexter und Naoko Yamazaki. Mit Hilfe des Greifarms des Space Shuttle suchten sie den Hitzeschild nach möglichen Beschädigungen ab.
Die für sieben Stunden angesetzte Inspektion war drei Stunden schneller als vorgesehen abgeschlossen. Die Arbeit wurde während der Ankopplung der Discovery an die Raumstation vorgenommen, weil die Ku-Band Antenne des Shuttles nicht funktionierte und daher die Bilder und Daten über die Antenne der Station zur Erde geschickt werden mussten.

Am 17. April 2010 koppelte die Discovery-Besatzung mittels Federkraft wieder von der ISS ab. Dadurch werden Beschädigungen oder Verunreinigungen der Station vermieden. Erst danach wurden die Steuerungstriebwerke aktiviert und die Raumfähre entfernte sich von ihr bis zu einer Distanz von etwa 150 Meter. Von dort aus umflog James Dutton die Orbitalstation eineinhalb Mal, ehe die Triebwerke der Discovery erneut gezündet wurden und der Raumgleiter seine Distanz vergrößerte. Die sonst nach der Abkopplung übliche letzte Überprüfung des Hitzeschutzschildes mit dem OBSS war wegen des Ausfalls der Ku-Band-Antenne vorgezogen worden.

Wegen zu niedriger Wolken in Florida musste die Landung um einen Tag verschoben werden.