Start von Cape Canaveral (KSC); Landung auf Cape Canaveral (KSC); ISS-MPLM Leonardo.

Bei der Mission STS-131 wurden das Logistikmodul Leonardo sowie der LMC-Träger genutzt, um Fracht zur ISS zu bringen. Darunter befand sich unter anderem ein Ammoniaktank, der mit STS-128 zur Erde zurückgeholt und nun wiederbefüllt zur Station zurückgebracht wurde.

Kurz nach dem Start fiel das Ku-Band Antennensystem der Discovery aus. Der Grund hierfür war zunächst nicht festzustellen. Die schüsselförmige Radarantenne wird beim Rendezvous-Manöver mit der Raumstation und zur Übertragung von Videos und Daten zwischen Boden und Raumschiff über NASA-Kommunikationssatelliten verwendet. Der Ausfall der Antenne beeinträchtigt nicht den erfolgreichen und sichern Verlauf der Mission. Discovery führte ein erfolgreiches Rendezvous und die Ankopplung mit der Raumstation durch und ist - falls erforderlich - in der Lage, alle geplanten Aufgaben erfolgreich ohne die Nutzung der Ku-Band Antenne durchzuführen.

Nach zweitägigem Alleinflug koppelte die Discovery am 07. April 2010 an die ISS an. Es folgten gemeinsame Arbeiten mit der ISS Expedition 23.

Am 08. April 2010 wurde das Leonardo Multipurpose Logistics Module von der Ladebucht der Discovery zu einem Andockpunkt am Modul Harmony umgesetzt. Das in Italien gebaute Modul enthält mehr als 7700 Kilogramm Versorgungsgüter. Darunter befinden sich vier Racks mit Experimenten sowie die letzten persönlichen Schlafkabinen für die Besatzung. Dies ist der letzte Einsatz des 6,4 Meter langen und 4,5 Meter breiten Moduls Leonardo. Nach der Rückkehr zur Erde wird das Modul mit einem Schutzschild an der Außenseite versehen. Die Mission STS-133 im Februar 2011 brachte Leonardo dann als dauerhaftes Modul zur Raumstation.

Die erste EVA durch Richard Mastracchio und Clayton Anderson wurde am 09. April 2010 (6h 27m) unternommen. Dabei wurde mit Hilfe des Roboterarms zunächst ein Ammoniak-Tank aus der Nutzladebucht gehoben und vorübergehend an der Station verstaut. Ammoniak wird benötigt, um überschüssige Wärme aus der Station zu den Radiatoren außerhalb der Station zu leiten. Dann bargen die beiden Astronauten ein Samen-Experiment von außerhalb des japanischen Labors. Anschließend wurden Haltevorrichtungen an den Ammoniak-Tank angebracht und ein defektes Gyroskop des Navigationssystems der Station ausgetauscht. Da die beiden Astronauten gut im Zeitrahmen lagen, wurden schon einige Arbeiten, die eigentlich später geplant waren, gleich mit erledigt, indem man z.B. schon 11 von 12 Befestigungsklammern löste.

Zwischenzeitlich entschieden die Manager der Mission, den Flug um einen Tag zu verlängern. So sollte eine späte Inspektion des Hitzeschildes der Discovery noch während der Kopplung mit der ISS gewährleistet werden.

Die zweite EVA durch Richard Mastracchio und Clayton Anderson erfolgte am 11. April 2010 (7h 26m). Mit Hilfe des Stationsarmes wurde der leere Ammoniaktank vom Truss abgebaut und vorübergehend auf dem Equipment-Cart verstaut. Anschließend wurde der neue Tank eingesetzt und befestigt. Während dieser EVA gab es aber massive Probleme mit einem Bolzen, um den Ammoniaktank zu befestigen. Der gesamte Zeitplan geriet durcheinander, bevor es Clayton Anderson dann doch nach 1,5 Stunden noch schaffte. Kühlleitungen konnten dann aber nicht mehr verlegt werden. Mit dem Stationsarm wurde dann der leere Tank nochmals versetzt.

Die dritte und letzte EVA führten Richard Mastracchio und Clayton Anderson am 13. April 2010 (6h 24m) durch. Zunächst wurden die schwierigen Arbeiten beim Wechseln des Ammoniktanks beendet. Mit Hilfe des Roboterarms der Station wurde der leere Ammoniaktank in die Ladebucht des Shuttle verfrachtet. Danach wurden die Haltevorrichtungen vom alten Tank entfernt und auf der Werkzeugplattform verstaut. Richard Mastracchio und Clayton Anderson bargen zum Abschluss dieser EVA noch einige Schutzkacheln vom Quest-Modul, um sie mit zur Erde zurückzubringen. Wegen der Verzögerungen wurden die geplante Installation einer Platte sowie einer Kamerabeleuchtung an Dextre, die Entfernung von Isoliermatten und die Auswechselung eine durchgebrannte Birne an einer Truss Kamera nicht mehr durchgeführt.

Danach versuchten die Ingenieure in der Kontrollstation ein klemmendes Ventil im Bereich des Stickstoff-Tanks zu lösen. Das Ventil ist erforderlich, um den durch die Astronauten der Discovery bei drei Außeneinsätzen von Richard Mastracchio und Clayton Anderson installierten Ammoniak-Tank unter Druck zu setzen.
Nach einigen Diskussionen entschieden die Flugleiter den erwogenen zusätzlichen Weltraumspaziergang und die durch erforderliche weitere Flugverlängerung um einen Tag nicht durchführen zu lassen. In dieser Zeit hätte der Stickstoff-Tank im Kühlsystem der Internationalen Raumstation ausgetauscht werden können. Die Ingenieure kamen zu dem Ergebnis, dass das Kühlsystem auch ohne das klemmende Ventil für einen längeren Zeitraum sicher betrieben werden kann.

Am 15. April 2010 verlegten Stephanie Wilson und Naoko Yamazaki das Leonardo Multipurpose Logistics Module mit Hilfe der Roboterarms der Raumstation zurück in die Ladebucht der Discovery, um Leonardo zurück zur Erde zu bringen.
Das Cargo-Modul Leonardo wurde mit erheblicher Verspätung von der ISS abgekoppelt und über Nacht in eine Parkposition über die Ladebucht der Space Shuttle gebracht. Erst am nächsten Morgen verankerten die Astronauten das Modul an der Discovery.
Die Rückverlegung von Leonardo in die Ladebucht der Discovery hatte sich wegen Problemen mit den Haltebolzen des MPLM verzögert.

Danach begannen Stephanie Wilson, Dorothy Metcalf-Lindenburger und Discovery Pilot James Dutton mit der späten Inspektion des Hitzeschutzschildes der Discovery. Sie arbeiteten in Schichten mit Hilfe von Kommandant Alan Poindexter und Naoko Yamazaki. Mit Hilfe der Roboterarms des Space Shuttle suchten sie den Hitzeschild nach möglichen Beschädigungen ab.
Die für sieben Stunden angesetzte Inspektion war drei Stunden schneller als vorgesehen abgeschlossen. Die Arbeit wurde während der Ankopplung der Discovery an die Raumstation vorgenommen, weil die Ku-Band Antenne des Shuttles nicht funktionierte und daher die Bilder und Daten über die Antenne der Station zur Erde geschickt werden mussten.

Wegen schlechten Wetters in Florida musste die Landung um einen Tag verschoben werden.