Start von Cape Canaveral (KSC); HST-SM-04; Landung auf der Edwards AFB.

Nach der Columbia-Katastrophe wurden Pläne für die Rettung einer Besatzung entwickelt, deren Shuttle nicht länger zum Wiedereintritt fähig war. Es wurde ein als Contingency Shuttle Crew Support (CSCS) bezeichnetes Profil mit der allgemeinen Missionsbezeichnung STS-3xx entwickelt, bei welchem die Crew auf die Internationale Raumstation evakuiert wird und dort auf ein Rettungsshuttle wartet. Dieses Profil setzt jedoch voraus, dass die Umlaufbahn der Internationalen Raumstation, welche eine Bahnneigung von 51,6° hat, das Flugziel der zu rettenden Mission ist. Diese Voraussetzung ist für eine Hubble-Wartungsmission mit einer Bahnneigung von 28,5° nicht gegeben und lässt sich auch nicht nachträglich durch Bahnmanöver erreichen. Entsprechend ließ die NASA weitere Hubble-Flüge vorerst fallen. Nachdem jedoch Wissenschaftler Druck auf die NASA ausübten, Hubble erneut anzusteuern, begann man nach einer ISS-unabhängigen Alternative zu suchen. Man entwickelte einen, auf mehreren Weltraumausstiegen in ein rasch gestartetes Rettungsshuttle basierenden, Plan, welcher als STS-400 den Missionsregeln für STS-125 beigefügt wurde. STS-125 ist somit die einzige Mission für die ein spezieller Rettungsplan erarbeitet wurde. Die Rolle des Rettungsshuttles hätte die Endeavour übernommen.

Das Einfangen des Hubble Teleskops und die erste EVA durch John Grunsfeld und Andrew Feustel erfolgten am 14. Mai 2009 (7h 20m) zum Austausch einer Wide Field Camera. Daneben wurden die ersten 3 Akkus ausgetauscht. Außerdem wurde eine Halterung angebaut, mit der ein Raumschiff das Teleskop später greifen kann, um es dann am Ende seiner Nutzungsdauer aus dem Orbit zu entfernen.

Die zweite EVA unternahmen Michael Massimino und Michael Good am 15. Mai 2009 (7h 56m) zum Austausch von 6 Gyroskopen (untergebracht in 3 Boxen) und weiterer 3 Akkus.

Die dritte EVA durch John Grunsfeld und Andrew Feustel erfolgte am 16. Mai 2009 (6h 36m) zur Installation des Cosmic Origins Spectrograph. Weiterhin unternahmen sie Reparaturarbeiten an der Advanced Camera for Surveys, die nicht mehr genügend Energie hatte. Das hatte dazu geführt, dass zwei von drei Observationskanälen nicht mehr arbeiteten.

Die vierte EVA unternahmen Michael Massimino und Michael Good am 17. Mai 2009 (8h 02m) zur Reparatur und Erneuerung des Space Telescope Imaging Spectrograph, das bereits 2004 seine Arbeit eingestellt hatte. Auch hier gab es seinerzeit Probleme mit der Energie. Daneben wurde die abgängige Isolierung des Hubble-Teleskops teilweise durch eine Stahlhülle ersetzt.

Die fünfte und letzte EVA wurde wieder durch John Grunsfeld und Andrew Feustel am 18. Mai 2009 (7h 02m) zum Austausch eines Sensors, der für die exakte Ausrichtung des Teleskops notwendig ist, und weiterer Austausch der Isolierung ausgeführt.

An 19. Mai 2009 wurde Hubble vom Shuttle abgetrennt. Megan McArthur ergriff dazu Hubble mit dem Roboterarm, entfernte es von der Wartungsplattform und hob es aus der Nutzlastbucht hinaus. Nachdem das Schutzschott des Spiegels geöffnet worden war, wurde das Teleskop um 12:57 UTC losgelassen. Anschließend wurde die Atlantis langsam vom Teleskop wegbewegt, bis sie weit genug entfernt war, um ihr Triebwerk zu aktivieren und sich weiter zu entfernen. Die Besatzung begann danach mit der Spätinspektion des Hitzeschildes und dem Einklappen der Wartungsbühne als Vorbereitung für die Landung. Durch eine Triebwerkszündung wurde das Perigäum der Bahn auf 300 km abgesenkt, um so die Gefahr durch Mikrometeoriten und Weltraummüll zu verringern

Wegen schlechten Wetters wurde die Landung um zwei Tage verschoben.