Start von Cape Canaveral (KSC); Nachtlandung auf Cape Canaveral (KSC). Wegen starker Winde musste der Start dreimal verschoben werden. Mission ISS-03-2A.2A.

Nach zwei Flugtagen erfolgte die Ankopplung der Atlantis an die Raumstation ISS am 20. Mai 2000. Hauptaufgaben der Atlantis-Mission waren Wartungsarbeiten, ein Außenbordeinsatz zur Montage eines Kranes und entsprechender Halterungen sowie das Anheben der Flugbahn der internationalen Raumstation.

Bereits einige Stunden nach dem Kopplungsmanöver erfolgte die EVA durch James Voss und Jeffrey Williams am 21. Mai 2000 (6h 44m). Dabei wurden letzte Installationsarbeiten an einem in Russland gebauten Kran vorgenommen, eine defekte Antenne ersetzt, ein Kamerakabel verlegt und einige Handgriffe montiert.

Nach den erfolgreichen Arbeiten im freien Weltraum wurden die Luken zur Station geöffnet und zunächst Luftproben an verschiedenen Stellen genommen. Untersucht wurden auch die Luftzirkulation und die Kohlendioxidkonzentration. Zu deren Verbesserung wurden Luftfilter gewechselt sowie mehrere Luftschläuche verlegt, verstärkt und mit einer besseren Schalldämpfung versehen. An den fünf Arbeitstagen in der Station wurden außerdem 4 Batterien im Sarja-Modul gewechselt, aufgeladen und getestet. Dazu gehörte auch die Elektronik, die das geregelte Auf- und Entladen der Batterien steuert. Turnusmäßig gewechselt wurden Feuerlöscher, Rauchmelder, Kühlventilatoren und die Speichereinheit eines Radio-Telemetriesystems. Unter der Aufsicht von Susan Helms wurden mehr als 1.000 Kilogramm Nutzlast in die Station transportiert. Dazu gehörten Bekleidung, Müllsäcke, 4 gefüllte Wasserbehälter, eine IMAX-Filmkamera, ein Laufband, ein Fahrradergometer, Werkzeug und Bücher. Damit alles sinnvoll untergebracht werden konnte, wurden zusätzliche Lagereinrichtungen im hinteren Teil von Sarja installiert.

Drei Antriebsperioden sorgten dafür, dass die Bahn der ISS um mehr als 40 Kilometer angehoben wurde. Damit befand sich die Station in der idealen Position für das Ankoppeln des Wohn- und Antriebsmoduls Swesda, das Mitte Juli 2000 in den Orbit gelangte.

Im Shuttle wurden während des Fluges nur wenige Experimente durchgeführt. So wurden Proteinkristalle für medizinische und analytische Zwecke hergestellt. Kommerziell wurde menschliches Alpha Interferon 2b gewonnen, das gegen Hepatitis B und C sowie gegen Melanome, Leukämie und das Kaposi-Sarkom wirksam ist. Im Rahmen des Protein Crystal Growth – Biotechnology Ambient Generic – Experiments (PCG-BAG) wurden insgesamt 504 verschiedene Proben aktiviert. Dabei wurden die kristallbildenden Komponenten erst in der Schwerelosigkeit zusammengebracht. Danach verdunstete die verdünnende Flüssigkeit und der Kristallbildungsprozess setzte ein. Komplettiert wurde das wissenschaftliche Forschungsprogramm durch ein Experiment in der Astoculture-Handschuhbox. Hier wurden 1.000 Sojabohnensamen Bakterien mit dem rs-GFP-Gen ausgesetzt. Dadurch entstehen Pflanzen, die das fremde Gen in ihr Erbgut einbauen. In der Schwerelosigkeit funktioniert dieses Verfahren effizienter als auf der Erde. Transgene Pflanzen sollen in Zukunft nicht nur resistenter gegen Schädlinge sein, sondern auch Medikamente produzieren können.

Zu den Routineaufgaben der STS-101-Crew gehörten die Untersuchungen zur Virus-Reaktivierung in der Schwerelosigkeit, zur Funktion des Immunsystems, zur Zusammensetzung der Kabinenluft und zur Navigation nach GPS-Daten. Derartige Navigationssysteme sollen sowohl in der Internationalen Raumstation als auch im damals noch geplanten Rettungsfahrzeug Crew Return Vehicle zum Einsatz kommen. Außerdem wurde ein Halbleitersensor getestet, mit dem auch größere Objekte in der Umlaufbahn erfasst werden können (bis zu 22,6 Bogenminuten).

Der Flug hätte beinahe ebenso wie bei dem späteren Unglück der Columbia in einer Katastrophe geendet, weil Hitzeschutzkacheln beschädigt waren. Da die eindringenden heissen Gase aber nicht weit in das Shuttle vordrangen, konnte ein Auseinanderbrechen des Orbiters vermieden werden. Die Beschädigungen mussten vor dem nächsten Flug der Atlantis repariert werden.