Der Start von STS-44 erfolgte von Cape Canaveral (KSC). Der Orbiter landete auf der Edwards AFB, Runway 05.

Der Start war zuerst für den 19. November 1991 geplant gewesen, wurde aber wegen eines defekten Trägheitssensors der Antriebsstufe eines Defense Support Program Satelliten (DSP) verschoben. Die Einheit wurde ausgetauscht und getestet, der Start anschließend für den 24. November 1991 neu angesetzt. Er musste nochmals um 13 Minuten verschoben werden, um einem Raumschiff im Orbit den sicheren Vorbeiflug zu erlauben und um den externen Flüssigsauerstofftank voll zu tanken.

STS-44 war eine weitere Mission für das Department of Defense (US-Verteidigungsministerium). Die nicht geheime Nutzlast enthielt den Defense Support Program Satelliten und dessen Inertial Upper Stage (IUS). Weitere Nutzlasten in der Ladebucht und im Mitteldeck waren Interim Operational Contamination Monitor (IOCM), Terra Scout, Military Man in Space (M88-1), Air Force Maui Optical System (AMOS), Cosmic Radiation Effects and Activation Monitor (CREAM), Shuttle Activation Monitor (SAM), Radiation Monitoring Equipment III (RME III), Visual Function Tester-1 (VFT-1) zum Testen des Sehvermögens im All, Ultraviolet Plume Instrument (UVPI), Bioreactor Flow and Particle Trajectory Experiment und Extended Duration Orbiter Medical Project.

Etwa zweieinhalb Stunden nach dem Start begann die Besatzung mit dem Checkout für die Aussetzung des Gespanns DSP-16/IUS. Der Satellit ist etwa 9,80 m lang und hat einen Durchmesser von etwa 4,20 m.
Für das Aussetzen wurden der Satellit und die Rakete auf die 29 Grad Position gedreht. James Voss schaltete beide Einheiten auf interne Energie. Dann, kurz vor dem Aussetzen, wurde das Gespann in die 58,5 Grad-Position gedreht. Sechs Stunden und achtzehn Minuten nach dem Start der Atlantis löste sich das Gespann aus der Verankerung. Siebzehn Minuten nach dem Aussetzen wurde Atlantis durch eine Zündung der Triebwerke auf eine höhere Umlaufbahn gebracht. Eine weitere Stunde später zündete die erste Stufe der IUS für 146 Sekunden. Fünf Stunden und zwanzig Minuten nach der ersten Zündung konnte dann auch die zweite Stufe gezündet werden. Nach einer Brenndauer von 108 Sekunden wurde die geostationäre Umlaufbahn erreicht. Etwa neun Stunden nach der Trennung von der IUS begann der Kreisel sich zu drehen. Damit konnte der DSP-Satellit gesteuert werden.

Am zweiten Flugtag sichteten die Astronauten die Raumstation MIR als kleinen Lichtpunkt in etwa 45 km Entfernung. Die Kosmonauten an Bord der MIR meldeten sich am dritten Flugtag bei der Crew der Atlantis. Sergej Krikaljow teilte per Funk mit, dass er den Start der Atlantis von der Raumstation aus habe mitverfolgen können.

TERRA SCOUT ist ein Erdbeobachtungsinstrument, das sich die Fähigkeiten einer trainierten Person zunutze macht, die die Beobachtungen durchführen. Thomas Hennen benutzte für seine Beobachtungen ein Gerät mit Namen "Spaceborn Direct-View Optical System" (SpaDVOS). Thomas Hennen konnte etliche der vorgegebenen Beobachtungsziele ausmachen.

M88-1 gehört zu einer Serie von Experimenten zur Ermittlung der visuellen und kommunikativen Fähigkeiten eines Menschen im All.

Das "Radiation Monitoring Equipment" (RME)-III Experiment maß die ionisierende Strahlung im Orbiter. Es maß die Gamma-, Elektronen-, Neutronen- und Protonenstrahlung und berechnet die Belastung für die Astronauten.

Mit dem "Shuttle Activation Monitor" (SAM) wurde die Gammastrahlung als Funktion der Zeit und des Ortes gemessen. Eine Messung dauerte ungefähr zwölf Stunden.

Ein mit dem SAM parallellaufendes Experiment ist CREAM ("Cosmic Radiation Effects and Activation Monitor"). Es dient zum Aufzeichnen der Spektren des Energieverlustes der kosmischen Strahlung, den Neutronenstrom und der induzierten Radioaktivität.

Beim "Ultraviolett Plume Instrument" (UVPI) dienen Sensoren dazu, die vom Strahl einer Raketendüse ausgesandte UV-Strahlung zu messen.

Mit dem "Visual Function Tester" (VFT)-1 sollte das Sehvermögen in der Schwerelosigkeit getestet werden. Einem Fernglas ähnlich ermöglichte es dem Astronauten, seine Ziele durch unterschiedlich einstellbare Beleuchtung zu beobachten.

Das "Bioreactor Flow and Particle Trajectory" (DSO-316)-Experiment diente dazu, die Dynamik in Flüssigkeiten zu beobachten.

Das "Air Force Maui Optical System" (AMOS) ist ein elektrisch-optisches Instrument, das auf der Hawaii-Insel Maui installiert ist. Damit wird das Space Shuttle im Erdorbit verfolgt, Triebwerkszündungen, Ablassen von Wasser und das sogenannte "Shuttle-Glühen" beobachtet.

Ein sogenanntes "COLA"-Manöver, um der Startrakete von Kosmos 851 auszuweichen, wurde während der Mission erforderlich.

Zu einem ernsten Problem entwickelte sich die "Inertial Measurement Unit" (IMU) 2. Etwa neun Stunden nach dem Start wurde sie aus Gründen der Energieersparnis abgeschaltet. Als sie später zu Testzwecken erneut eingeschaltet wurde, arbeitete sie zunächst fehlerfrei. Nach 12 Stunden musste die NASA die IMU 2 für nicht betriebsbereit erklären, nachdem sie offensichtlich fehlerhafte Daten lieferte. Obwohl ein Shuttle mit nur einer IMU fliegen und auch landen kann, sind zwei für die höhere Genauigkeit natürlich besser. Die Sicherheitsbestimmungen der NASA verlangen aber drei funktionierende IMU. Unmittelbare Folge der nicht betriebsbereiten IMU 2 war ein vorzeitiger Flugabbruch ("Minimal Duration Mission"). Dies war erst das zweite Mal, dass ein Shuttle-Flug wegen technischer Probleme abgebrochen werden musste. Der erste Flugabbruch war STS-2 im November 1981.

Nach der ursprünglichen Flugplanung sollte STS-44 erst am 04. Dezember 1991 zum Kennedy Space Center zurückkehren. Bei einer defekten IMU sehen die Sicherheitsvorschriften der NASA aber zwingend eine Landung in Kalifornien auf der Edwards AFB vor.