Start von Cape Canaveral (KSC); Landung auf der Edwards AFB, Runway 22. Der Start wurde wegen schlechter Wetterbedingungen um eine Stunde verschoben.
Während des Countdowns waren ähnlich tiefe Temperaturen wie bei der Challenger-Tragödie STS-51L aufgetreten. Dabei bereiteten weniger die überarbeiteten und verstärken O-Ringe an den Feststoffboostern sorge, vielmehr befürchtete man, dass sich beim Auftanken und Nachtanken des braunen Außentanks Eis bilden könnte. Bei den Erschütterungen während des Starts könnte das Eis herabfallen und den Orbiter beschädigen. Rechtzeitig vor Beginn der Betankung waren die Temperaturen auf über 10 Grad Celsius gestiegen, lagen also über dem Grenzwert von 8,3 Grad Celsius.

Ursprünglich war Mary Cleave als Missionsspezialistin vorgesehen. Da sie die NASA aus persönlichen Gründen verließ, wurde sie im Januar 1990 durch Manley Carter ersetzt. Manley Carter kam im April 1991 bei einem Flugzeugabsturz ums Leben. David Hilmers übernahm seine Aufgaben.

Mit STS-42 erfolgte der erste Flug des Internationalen Mikrogravitationslabors IML-1. Dieses auf dem Spacelab basierende Modul enthielt Experimente, um die komplexen Effekte der Schwerelosigkeit auf lebende Organismen und andere Materialien zu erforschen. Um Experimente rund um die Uhr durchführen zu können, arbeitete die Besatzung im Schichtbetrieb. Ronald Grabe, Stephen Oswald, Norman Thagard und Roberta Bondar bildeten das blaue Team, während David Hilmers, William Readdy und Ulf Merbold das rote Team bildeten. Zusätzlich zu den Experimenten im IML-1 befanden sich 10 Get-Away-Kanister in der Nutzlastbucht, in denen automatische Experimente abliefen. Auf dem Mitteldeck des Shuttles befanden sich zudem Experimente zu biologischen Themen.

Vor Beginn der Arbeiten im Spacelab musste Kommandant Ronald Grabe den Orbiter in eine spezielle Fluglage bringen. Da bei STS-42 viele Experimente beschleunigungsempfindlich waren - also eine sehr niedrige Mikrogravitation benötigten - durften die Lageregelungstriebwerke nur so selten wie möglich gezündet werden. Die hierfür bestmögliche Fluglage - der sogenannte Gravity Gradient Attitude - wird erreicht, wenn das Space Shuttle senkrecht zur Erdoberfläche mit dem Heck zur Erde gewandt positioniert wird.

55 Versuche auf den Gebieten der Lebenswissenschaften, Materialwissenschaften und Fluid-Physik standen bei dieser Mission zur Bewältigung an. Pilot Stephen Oswald hatte als Sonderaufgabe Filmaufnahmen von Afrika und Europa zu machen, die später für den Film "Destiny in Space" (Schicksal im All) verwendet werden sollten. Wolken über diesen Gebieten erschwerten seine Arbeit aber erheblich.
Im Biorack, einer von der ESA entwickelten und bei STS-9 erprobten Versuchsanlage, wurden allein 17 der internationalen Experimente zu den Effekten der Mikrogravitation und der kosmischen Strahlung auf Pflanzen, Gewebe, Zellen, Bakterien, Fruchtfliegen, Froscheiern und anderen biologischen Proben untersucht werden.
In der Gravitational Plant Physiology Facility (GPPF) wurden Weizen-Sämlinge in kleinen Zentrifugen verschiedenen Beschleunigungskräften und in einer benachbarten Kammer des Gerätes unterschiedlichen Lichtintensitäten ausgesetzt.
In der von der ESA erbauten Critical Point Facility (CPF) wurden Fluide am sogenannten kritischen Punkt untersucht. Das ist der Punkt, an dem bei gleicher Temperatur und gleichem Druck der Dampf und die Flüssigkeit eines Fluids dieselbe Dichte besitzen.
Im aus Deutschland stammenden Gerät Cryostat wurden Proteinkristalle gezüchtet, die später auf der Erde hinsichtlich ihrer Eigenschaften untersucht wurden. Dabei sollte mehr über den Aufbau der Proteinmoleküle erforscht werden und welchen Zweck sie in Pflanzen und Tieren erfüllen.
Eine Untersuchung mit der Bezeichnung CELLS beschäftigte sich mit dem Wachstum von Knorpelzellen. Die Schwächung dieser Zellen, die bei früher mit dem Shuttle geflogenen Nagetieren, soll auch verantwortlich für Missbildungen am Knochenskelett von Kindern sein. Durch die Untersuchungen wollte man feststellen, wie das Knorpelwachstum auf der Erde erfolgt und ob Knochen im Weltraum eventuell besser heilen.
Zur Untersuchung des Space Adaption Syndrom nahm insbesondere Ulf Merbold mit einer Art Schlitten Experimente vor, die Aufschluss über die Funktionsweise des Vestibular-Organs im Innenohr bei Schwerelosigkeit geben sollen.
In der Anlage Vapor Crystal Growth System (VCGS) wurde eine Ampulle mit einem auf der Erde vorgezüchteten Quecksilberoxid-Kristallkern über Heizelemente zum Wachstum angeregt. Doch schon nach kurzer Zeit zeigte sich, dass sich am Kristallkern stattdessen mehrere kleine Kristalle gebildet hatten. Erst nach einer veränderten Temperatureinstellung wuchs auch das Ursprungskristall.

Um alle wissenschaftlichen Experimente ausführen zu können, wurden der Flug um einen Tag verlängert.