Start von Cape Canaveral (KSC); Landung auf der Edwards AFB.

Nach ursprünglichen Planungen hätte die Mission am 16. Mai 1990 beginnen sollen. Wegen eines Fehlers im Kühlsystem des Orbiters wurde der Start aber zunächst auf den 30. Mai verschoben. Beim Betanken für den Start stellte man jedoch fest, dass es im Außentank zwei größere Lecks gab, die nicht auf der Startrampe repariert werden konnten, deshalb wurde das Shuttle zurück ins Vehicle Assembly Building (VAB) gerollt. Deshalb und wegen einiger weitere Probleme, die sich in der Folge ergaben, wurde der Start um einige Monate verzögert, mehr als je ein anderer Shuttleflug zuvor. Diese Verzögerung führte dazu, dass der Flug STS-41 der Raumfähre Discovery vor STS-35 durchgeführt wurde. Dabei kam es zu einem weiteren Novum in der Shuttle-Geschichte, zum ersten Mal waren zwei Shuttles gleichzeitig auf der Startrampe.

Vance Brand war bis dahin der älteste Astronaut, der je ins All gestartet ist.

Hauptziel der Mission waren astronomische Beobachtungen mit den Geräten der ASTRO-1-Platform im Bereich der UV- und Röntgenstrahlen. Die ASTRO-1-Einheit wurde in der Nutzlastbucht mitgeführt und enthielt folgende Instrumente:
1. Hopkins Ultraviolet Telescope (HUT); ein Teleskop für den ultravioletten Spektralbereich mit 90 cm Spiegeldurchmesser. HUT wurde von der Johns-Hopkins-Universität in Baltimore entwickelt. Es enthielt einen Spektrographen, der die Wellenlängenbereiche 82,5 bis 185 nm und 42 bis 92,5 nm mit etwa 0,3 nm Auflösung abdeckte. Dasselbe Instrument flog später nochmals auf der Mission STS-67.
2. Wisconsin Ultraviolet Photo-Polarimeter Experiment (WUPPE); ein Teleskop mit 50 cm Spiegeldurchmesser für Spektroskopie und Polarimetrie im ultravioletten Spektralbereich. WUPPE wurde an der University of Wisconsin entwickelt und nahm Spektren im Wellenlängenbereich 140 bis 330 nm mit einer Auflösung von 0,6 nm auf, während der beiden Missionen wurden insgesamt 260 Datensätze von 186 Himmelsobjekten (hauptsächlich Sterne) gewonnen.
3. Ultraviolet Imaging Telescope (UIT); ein Teleskop für den ultravioletten Spektralbereich (120 bis 330nm) mit 38 cm Spiegeldurchmesser. Entwickelt wurde es vom Goddard Space Flight Center der NASA. Das Gesichtsfeld von UIT betrug 40 Bogenminuten mit einer räumlichen Auflösung von drei Bogensekunden. Während des Fluges wurden 821 Aufnahmen von 66 Objekten gewonnen, dasselbe Instrument flog später nochmals während der Mission STS-67.
4. Broad Band X-Ray Telescope (BBXRT); dieses Instrument für die Röntgenastronomie bestand aus zwei Teleskopen mit einem Durchmesser von je 44 cm. Das Instrument wurde vom Laboratory for High Energy Astrophysics der NASA entwickelt und gebaut. Es war nicht auf der ASTRO-1-Plattform montiert, es wurde einfach in der Nutzlastbucht des Shuttles mitgeführt.

Die Bedienung der Teleskope erfolgte im Schichtbetrieb. Während der Mission gab es einige technische Probleme, so funktionierten zum Beispiel die Displays zum Ausrichten der ASTRO-1-Teleskope nicht. Die Teleskope mussten deshalb von der Erde aus gesteuert werden, die Feinausrichtung erfolgte dann durch die Crew an Bord. Die wissenschaftlichen Ziele konnten daher nur zu etwa 70 Prozent erreicht werden. Schwierigkeiten ergaben sich auch mit der Abwasserbeseitigung, weil ein Abflussrohr verstopft war, so dass man auf Ersatzbehälter zurückgreifen musste.

Zu den weiteren Experimenten gehörten das Shuttle Amateur Radio Experiment-2 (SAREX-2) und erneut AMOS. Die Missionsdauer wurde dann um einen Tag verkürzt, weil schlechtes Wetter im Landegebiet aufzog.