Start von Cape Canaveral (KSC); Landung auf der Edwards AFB. Mission ISS-06-5A Lab "Destiny". Der ursprünglich für den 19. Januar 2001 festgesetzte Start musste wegen technischer Probleme abgesagt werden. Diese erforderten eine Rückführung des Space Shuttles zum Montagegebäude VAB, um die Kabel für die Trennung der Feststoffraketen zu kontrollieren.

Nach zweitägigem Alleinflug koppelte die Atlantis am 09. Februar 2001 an die Raumstation ISS an. Die Atlantis dockte als erstes Raumschiff an den Kopplungsadapter PMA-3, welcher sich zum damaligen Zeitpunkt am Nadir-Port von Unity befand, an. Es folgten gemeinsame Arbeiten mit der ersten Expedition zur ISS.

Am Morgen des 11. Februar 2001 demontierte Marsha Ivins mit Hilfe des Manipulatorarms der Atlantis den Kopplungsadapter PMA-2 von Unity und transportierte ihn an eine vorgesehene Zwischenposition an der Gitterstruktur der Station. Erst danach erfolgte die erste EVA durch Thomas Jones und Robert Curbeam am 10. Februar 2001 (7h 34m). Nach dem Verlassen der Schleuse begab sich Thomas Jones zur Gitterstruktur und kontrollierte die korrekte Position des Adapters. Danach fungierte er als Lotse für den Transport des Labormoduls Destiny. Robert Curbeam hatte währenddessen die Halterungen von Destiny sowie die Stromkabel und Kühlleitungen gelöst sowie Schutzverkleidungen von den Kopplungsmechanismen entfernt. Mit dem Manipulator wurde das Modul anschließend aus der Ladebucht gehoben, um 180° gedreht und in die korrekte Position am Modul Unity gebracht. Automatische Kopplungsbolzen sicherten anschließend die Verbindung. Dann verbanden Thomas Jones und Robert Curbeam eine Reihe von Strom- und Datenkabeln sowie Kühlmittelleitungen zwischen Unity und Destiny. Aus einer der Leitungen trat dabei eine geringe Menge Ammoniak in kristalliner Form aus. Um eine Kontamination des Shuttle zu vermeiden, hielt sich Robert Curbeam eine halbe Stunde lang im direkten Sonnenlicht auf, um die Kristalle verdampfen zu lassen. Thomas Jones bürstete ihn und die Ausrüstung zusätzlich ab. Nach dem Wiedereinstieg und einem Druckausgleich zwischen Schleuse und Shuttle-Kabine trugen die Astronauten etwa 20 Minuten lang Atemmasken. Danach konnte eine Kontamination ausgeschlossen werden.

Anschließend betraten beide Crews das neue Modul und arbeiteten am Anschluss und der Aktivierung wichtiger Anlagen. Dazu gehörten Luftventilation, zwei Kühlsysteme auf Wasserbasis (4°C- und 17°C-System), zwei sogenannte Avionics-Racks mit Steuerungssystemen für die interne Kommunikation, für Lageregelung, Lebenserhaltung, Umweltdaten, Befehls- und Datenverarbeitung sowie das Energiesystem. Zusätzlich installiert wurde ein Rack mit einem Luftaufbereitungssystem. Es absorbiert normalerweise Kohlendioxid aus der Stationsluft und unterstützt damit das Vosduch-System, das im Modul Swesda untergebracht ist, konnte aber wegen eines Defekts nicht in Betrieb genommen werden. Aktiviert wurden aber die Bordcomputer sowie das Feuermelde- und Alarmsystem.

Die zweite EVA durch Thomas Jones und Robert Curbeam erfolgte am 12. Februar 2001 (6h 50m). Dabei wurde zunächst der Kopplungsadapter PMA-2 von seiner zeitweiligen Position am Gitterelement Z1 zur Front des Labormoduls Destiny transportiert und dort angekoppelt. Danach befestigten sie Abdeckungen an den Haltebolzen im Laderaum der Atlantis, montierten einen Entlüftungskanal, mehrere Halterungen und Spanndrähte für spätere Außenbordarbeiten und einen Sockel für den kanadischen Manipulatorarm der Station an Destiny. Anschließend konnten noch Strom- und Datenleitungen zwischen dem Labormodul und dem Kopplungsadapter verbunden werden, die Verkleidung am Fenster des Labormoduls entfernt und eine Fensterklappe montiert werden, deren Schließmechanismus von innen bedient werden kann. Während des Wiedereinstiegs der beiden Astronauten wurden die Gyroskope auf Touren gebracht. Sie wurden an den folgenden Tagen umfassend getestet und übernehmen seither die Lageregelung für die gesamte Station. Die Steuerung erfolgt durch die Bordcomputer des Labormoduls.

Die dritte und letzte EVA unternahmen Thomas Jones und Robert Curbeam am 14. Februar 2001 (5h 25m). Die Astronauten montierten eine Reserve-Antenne (S-Band), überprüften sorgfältig die physikalischen Verbindungen zwischen Destiny und dem Kopplungsadapter PMA-2 und lösten die Sicherung des dritten Radiators an der Gitterstruktur. Es war der 100. amerikanische Weltraumspaziergang.

Am letzten gemeinsamen Arbeitstag mit der ISS-Mannschaft wurden weitere Materialien in die Station transportiert. Zu den insgesamt 1,5 Tonnen Versorgungsgütern gehörten neben Wasser und Nahrung vor allem Ersatzteile, Bekleidung, Werkzeug, Computerzubehör, ein Ersatzcomputer, eine Reserveanlage zur Kohlendioxidabsorption und ein Raumanzug für Außenbordeinsätze. In der Gegenrichtung wurden 420 Kilogramm Abfall und Verpackungsmaterial entsorgt. Außerdem fanden eine Videokonferenz mit Schülern in Maryland sowie eine Pressekonferenz mit Journalisten und Wissenschaftlern in den Kontrollzentren in Houston und Moskau statt. An den zurückliegenden Tagen war die Bahn des Komplexes während vier Antriebsperioden um knapp 30 Kilometer angehoben worden.

Während der Mission wurden auch einige kleinere wissenschaftliche Untersuchungen angestellt. Zum einen wurde ein mit einer Vielzahl von eingefrorenen Proteinproben gefülltes Gefäß in die Station transportiert. Das Gefäß ist von flüssigem Stickstoff umgeben. Dieser verdampft allmählich, wodurch die Temperatur im Gefäß steigt und die Proben auftauen. Nach etwa 11 Tagen beginnt dann die Kristallisation der Proteine. Die Proben wurden zur genaueren Untersuchung bei der Mission STS-102 im März 2001 zurück zur Erde gebracht. Das Student Crystal Experiment wurde von über 400 Schülern 89 amerikanischer Schulen geplant. Mit diesem und weiteren Experimenten (SEEDS, EarthKAM) will die NASA Interesse und Begeisterung an der bemannten Raumfahrt fördern.

Wegen schlechten Wetters am Kennedy Space Center musste die Landung um zwei Tage verschoben und der Landeort zur Edwards AFB verlegt werden.