Start von Cape Canaveral (KSC); Landung in Cape Canaveral (KSC).

Hauptlast war der fünfte Datenrelaissatellit (TDRS-F) der TDRS-Reihe (Tracking and Data Relay Satellite), der 6 Stunden und 13 Minuten nach dem Start ausgesetzt wurde. Später brachte ihn eine IUS-Oberstufe (Inertial Upper Stage) auf seine endgültige Umlaufbahn.

Daneben gab es noch folgende Experimente an Bord: das Diffuse X-ray Spectrometer (DXS), mit dem Daten über die Röntgenstrahlung diffuser Quellen im Weltall aufgezeichnet wurden, und dass sich zu Beginn der Mission selbständig aufgrund eines technischen Problems ausschaltete, später aber einwandfrei funktionierte, der Commercial General Bioprocessing Apparatus (CGPA), das Chromosome and Plant Cell Division in Space Experiment (CHROMEX) zum Studium des Pflanzenwachstums, das Physiological and Anatomical Rodent Experiment (PARE) zur Untersuchung des Skeletts und dessen Anpassung an die Schwerelosigkeit, das Space Acceleration Measurement Equipment (SANS), um die Gravitationskräfte im erdnahen Raum zu messen sowie das Solid Surface Combustion Experiment (SSCE) zur Messung der Ausbreitungsrate und Temperatur von brennendem Filterpapier. Auch eine neue Bordtoilette wurde getestet.

Die einzige EVA während des Fluges von STS-54 erfolgte durch Gregory Harbaugh und Mario Runco am 17. Januar 1993 (4h 18m). Dabei wurden Übungen für den Aufbau einer Raumstation durchgeführt.