Start von Cape Canaveral (KSC); Landung auf der Edwards AFB. Der Start der Mission war ursprünglich für den 22. Mai 1991 geplant. Weniger als 48 Stunden vor dem Start wurde dieser verschoben, weil während einer bereits 1990 durchgeführten Überprüfung an einem Messfühler für flüssigen Wasserstoff des Hauptantriebes Mängel festgestellt wurden. Die Ingenieure befürchteten, dass einer oder mehrere der neun Wasserstoff- und Sauerstoff-Messfühler, welche die Treibstoff- und Sauerstoff-Leitungen überwachen, abbrechen und die Triebwerkspumpen beschädigen könnten, was zu einem Triebwerksausfall führen würde. Der Start wurde auf den 01. Juni 1991 angesetzt, aber abermals verschoben, nachdem mehrere Versuche fehlgeschlagen waren, die untätige Messeinheit 2 zu kalibrieren. Auch dieses Modul wurde ersetzt und getestet, der Start für den 05. Juni 1991 geplant.

STS-40 war die fünfte Spacelab-Mission, die erste, die sich ausschließlich mit Biowissenschaften beschäftigte. Das wichtigste Experiment war Spacelab Life Sciences-1 (SLS-1). Dabei wurden physiologische Untersuchungen an Menschen, 30 Nagetieren und tausenden winzigen Quallen durchgeführt. Von den 18 Untersuchungen beschäftigten sich zehn mit dem Menschen, sieben mit den Nagetieren und eines mit den Quallen. Die sechs untersuchten Körpersysteme waren das Kreislaufsystem (Herz, Lunge, Blutgefäße); das Nierensystem; das Blut sowie Blutplasma; das Immunsystem (weiße Blutkörperchen); das Skelett sowie das Muskelsystem; das Zentralnervensystem (Hirn, Nerven, Augen und Innenohr).

Weiterhin waren zwölf Getaway Special (GAS) Kanister für Experimente in Materialwissenschaften, Biologie und Kosmische Strahlung, Middeck Zero-Gravity Dynamics Experiment (MODE) sowie sieben Orbiter Experiments (OEX) in der Nutzlast enthalten. Millie Hughes-Fulford wurde die erste weibliche Nutzlastspezialistin.