Start von Cape Canaveral (KSC) ebenfalls Landung auf Cape Canaveral (KSC), Runway 15.

Hauptaufgaben der Mission (ISS-03-2A.2B) waren der Transport von Versorgungsgütern, die Vorbereitung der Station auf die Ankunft der ersten Stammbesatzung und Montagearbeiten außerhalb der Station.

Nach dem Erreichen der Erdumlaufbahn öffnete die Besatzung die Frachtraumtüren der Atlantis, testete den Greifarm RMS in seinen verschiedensten Funktionen, klappte die für das Rendezvous erforderliche Ku-Band-Antenne aus und begann mit der Angleichung der Flugbahn zur Internationalen Raumstation. Ebenso montierten sie im "Orbiter Docking System" die "Centerline Camera", die Kommandant Terrence Wilcutt das spätere Docking erleichtern soll.

Den Gesetzen der Bahnmechanik folgend holte die Atlantis von ihrer ersten Umlaufbahn und weiteren Triebwerkszündungen in den folgenden beiden Tagen immer mehr zur Internationalen Raumstation auf. Am dritten Flugtag, dem 10. September 2000, hatte die Atlantis einen Punkt 15 Kilometer hinter der Raumstation erreicht. Für den Anflug im Rahmen des sogenannten "R-Bar Approach" musste das Space Shuttle nochmals seine Bahn senken, sodass sich die Atlantis schließlich etwa 180 Meter unterhalb der Internationalen Raumstation befand. Ab dieser Distanz übernahm Terrence Wilcutt die manuelle Steuerung und flog entlang des sogenannten "R-Bar" (gedachte Verbindungslinie zwischen der Raumstation und dem Erdmittelpunkt) hinauf zur ISS. Nach den üblichen Haltepunkten bei 52 Meter und 9 Meter vor der ISS reduzierte er die Annäherungsgeschwindigkeit auf zuletzt nur noch 3 Zentimeter pro Sekunde. Wie die Kommandanten bei allen Kopplungsmissionen steuerte er den Raumgleiter von der hinteren Konsole im Flugdeck aus, weil er von dort freie Sicht auf die Raumstation hatte. Ohne Probleme konnte er sein Raumschiff an die ISS ankoppeln.

Die einzige EVA des Fluges wurde durch Edward Lu und Juri Malentschenko am 11. September 2000 (6h 14m) unternommen. Dabei wurden Kabel zwischen Swesda und dem Sarja-Modul verlegt und ein Magnetometer installiert. Das Magnetometer gehört zu einem Navigationssystem, mit dem die Lage der Station im Raum anhand der Richtung und Stärke des Erdmagnetfeldes bestimmt werden kann. Von den insgesamt 9 Kabeln dienen 4 der Energieversorgung, 2 gehören zu einem stationsweiten Videosystem, 2 sind Datenleitungen zur Steuerung der Solarzellen von Sarja über die Orientierungssysteme von Swesda. Ein Glasfaserkabel verbessert in Zukunft die Kommunikation bei Ausstiegsmanövern.

Nach dem Öffnen der 12 Luken wurde zunächst die Qualität der Luft im neuen Modul Swesda überprüft. Zu den insgesamt rund 3 Tonnen Material, die aus einem Doppel-Spacehab-Modul in der Ladebucht der Atlantis und aus dem angedockten Transportraumschiff Progress M1-3 entladen wurden, gehörten Nahrungsmittel, Bekleidung, 6 gefüllte Wasserbehälter, medizinische Ausrüstung, ein Amateurfunkgerät für das ARISS-Projekt, Computer nebst Zubehör und persönliche Artikel der ersten Stammbesatzung. Außerdem wurden zwei Raumanzüge vom Typ "Orlan" in der Ausstiegsschleuse installiert, drei zusätzliche Batterien mit Ladekontrollgeräten, Spannungs- und Stromstabilisatoren in Swesda montiert, zwei ältere Batterien in Sarja ausgetauscht und Konverter zum Energieaustausch zwischen amerikanischen und russischen Systemen eingebaut. Demontiert und zur Erde zurückgebracht wurde das Annäherungs- und Kopplungssystem Toru im hinteren Teil von Sarja. Zu den Montagearbeiten der Crew gehörte auch die Installation einer Toilette, eines Sauerstoffgenerators vom Typ Elektron, bei dem auf elektrolytischem Wege Sauerstoff aus Wasser gewonnen wird, eines Kohlendioxidfilters und eines Laufbandes. Dieses ist auf einer speziellen Plattform montiert, die von der Außenwand der Station weitgehend isoliert ist. Dadurch sollen sich die beim Training der Raumfahrer entstehenden Bewegungen nicht auf die gesamte Station übertragen und somit empfindliche Experimente stören können. Des Weiteren wurden Ladestationen für angedockte Raumschiffe in Swesda installiert, Feuerlöscher und Schutzmasken für Notfälle betriebsbereit gemacht und Arbeiten am Ventilationssystem ausgeführt. Der Geräuschpegel war nach diesen Arbeiten nach Aussage der Crew nicht höher als im Shuttle. Während des gemeinsamen Fluges wurde die Bahn der Station in 4 Antriebsperioden um etwa 22,5 Kilometer angehoben.

Im Shuttle flogen mehrere Experimente mit, die weitgehend automatisch abliefen. Dazu gehörten Untersuchungen zum Einfluss der Schwerelosigkeit auf die Entwicklung des Nervensystems von Fruchtfliegen sowie zu Veränderungen des Erbgutes von Nierenzellen und der Bildung von Nierengewebe (Commercial Generic Bioprocessing Apparatus), Experimente von Schülern und Studenten verschiedener amerikanischer Schulen in Spezialbehältern (Getaway Special 782 und Space Experiment Module 8), die Erprobung eines aus kleinen, autonomen Einheiten bestehenden Mess- und Aufzeichnungssystems, das seine Daten drahtlos an eine Zentrale übermittelt (HTD 1403 Micro Wireless Instrumentation System) und die Demonstration der Funktionsfähigkeit eines neuen, preiswerten Systems zur Gewinnung großer und reiner Proteinkristalle (Protein Crystal Growth Enhanced Gaseaus Nitrogen Devar). Dabei werden Materialproben auf der Erde schockgefroren und in einem Gefäß mit flüssigem Stickstoff untergebracht. Im Weltraum siedet und verdampft der Stickstoff dann langsam und gibt damit die Kristallisation der Proben frei. Diese geschieht sehr langsam, wodurch extrem große Proteinkristalle entstehen. Proteine spielen bei allen Lebensprozessen im menschlichen Körper eine große Rolle. Große Kristalle lassen sich durch Röntgenstrahlung gut untersuchen und ihr Aufbau feststellen.

Weitere Routineexperimente betrafen die Navigation mit Hilfe des Global Positioning Systems, die Reaktivierung ruhender Viren in der Schwerelosigkeit, die Funktion des Immunsystems und die Untersuchung von Gleichgewichtsstörungen und der Wiederanpassung an die Schwerkraft nach dem Raumflug.

Am 18. September 2000 koppelte die Atlantis-Besatzung mittels Federkraft wieder von der ISS ab. Dadurch werden Beschädigungen oder Verunreinigungen der Station vermieden. Erst danach wurden die Steuerungstriebwerke aktiviert und die Raumfähre entfernte sich von ihr bis zu einer Distanz von etwa 150 Meter. Von dort aus umflog Scott Altman die Orbitalstation eineinhalb Mal, ehe die Triebwerke der Atlantis erneut gezündet wurden und der Raumgleiter seine Distanz vergrößerte.